NUEVAS TECNOLOGÍAS DE DIAGNÓSTICO

Los aptámeros son segmentos cortos de ácidos nucleicos (oligonucleótidos) de cadena sencilla (RNA o DNA) o moléculas peptídicas capaces de unirse a una molécula diana con alta especificidad y afinidad debido a su estructura tridimensional.

Tienen una longitud de entre 70 y 100 nucleótidos, con una región central de tamaño variable (entre 30 y 60 nucleótidos) de secuencia aleatoria y dos regiones flanqueantes de secuencia conocida para su amplificación por PCR. Pueden adoptar estructuras globulares que les permiten reconocer moléculas uniéndose a ellas de forma estable y específica.

Los aptámeros tienen multitud de aplicaciones, tanto en diagnóstico como en tratamiento, sirviendo como alternativa al uso de anticuerpos monoclonales. Además presentan ventajas frente a éstos: son más sencillos de producir, se pueden modificar con facilidad, pueden reconocer cualquier diana (inmunogénicas y no inmunogénicas) y no sólo inmunogénicas como hacen los anticuerpos, y no generan respuesta inmune en el organismo.

Sin embargo, el uso de aptámeros en el ámbito clínico está aún en sus inicios y, aunque hay varios ensayos clínicos en marcha para su uso diagnóstico y terapéutico, queda mucho por investigar en este campo.

Los aptámeros se seleccionan a través del método SELEX (Enriquecimiento Exponencial en Presencia del Ligando). Este método consiste en poner en contacto una librería inicial de oligonucleótidos con nuestra molécula diana. De esa manera que algunos oligonucleótidos, gracias a su estructura tridimensional, quedarán unidos a la diana mientras que el resto se eliminarán tras una serie de lavados. Los oligonucleótidos unidos se recuperarán y amplificarán por PCR para tener en cada ronda de selección una librería de los oligonucleótidos con más afinidad por la molécula diana. En la última ronda de selección se secuenciarán los oligonucleótidos para identificar los aptámeros candidatos afines a nuestra molécula diana.

El ELONA se realiza en una placa con 96 pocillos. Cuando el ELONA es directo, se coloca la molécula diana en el fondo del pocillo (en el ejemplo la proteína retrotranscriptasa del VIH). Posteriormente, se añade otra proteína llamada BSA (albúmina de suero bovino) para cubrir los huecos que hayan podido quedar en el fondo del pocillo. Luego se añade el aptámero marcado con digoxigenina, que es una pequeña molécula que sirve de unión al anticuerpo antidigoxigenina unido a la enzima HRP (peroxidasa del rábano). Cuando añadimos el ABTS (sustrato de la HRP), si el aptámero se ha unido a la molécula diana, se produce una reacción que genera un cambio de color en el líquido del pocillo y cuya intensidad o absorbancia puede medirse. Si, en cambio, el aptámero no es específico y no se une a la molécula diana, no habrá reacción y no se generará color.

Existen además otros tipos de ELONA denominados sandwich en los que se emplea una combinación de aptámeros (uno capturador y otro detector) para detectar la molécula diana, aumentando la sensibilidad del experimento.

Las técnicas actuales de diagnóstico del VIH sólo permiten detectar el virus después de los primeros 10 días tras la infección utilizando técnicas moleculares (que reconocen directamente al virus a través de su ARN o sus proteínas) y a partir de las 3 semanas empleando técnicas serológicas (que reconocen los anticuerpos específicos frente al virus) o 2 semanas si se emplean ELISAS de última generación (4º y 5º generación) que detectan anticuerpos y proteína P24 del virus. El 40% de las nuevas transmisiones del VIH ocurren durante la fase aguda de la infección en ausencia de tratamiento debido a la alta carga viral en las primeras 3 semanas de la infección, antes de que empiecen a generarse anticuerpos frente al virus. Por ello es necesario desarrollar nuevas técnicas diagnósticas moleculares capaces de reconocer al virus desde el inicio de la infección. Los aptámeros son una interesante opción para el desarrollo de estas nuevas técnicas, ya que son capaces de reconocer a las proteínas virales que son más abundantes que el material genético del virus (2 cadenas de ARN por virión).

Los ELONAS presentan ciertas limitaciones a la hora de la detección requiriendo una alta carga viral para su detección. Por ello, es necesario el desarrollo de nuevos métodos de detección ultrasensibles.

En EPIMOLVIH llevamos desde el 2018 trabajando con aptámeros. Hemos identificado péptidos de 5 proteínas virales altamente conservados en todas las variantes del VIH para seleccionar distintos aptámeros para la detección molecular del VIH, evaluando su sensibilidad, afinidad y especificidad para su futura implementación diagnóstica. A su vez, estamos probando nuevas tecnologías de detección basadas en el uso de aptámeros que permitan el diagnóstico precoz en los primeros 10 días de la infección..

Puedes encontrar más información sobre nuestros proyectos con aptámeros aquí.

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